Rabu, 26 Januari 2011

kromatografi penukar ion

KROMATOGRAFI PENUKAR ION

I. TUJUAN
Memisahkan ion magnesium dan ion seng dengan kromatogrfi penukar ion dan menetapkan konsentrasi ion magnesium dan ion seng dengan titrasi kompleksometri

II. PRINSIP
1. Migrasi Differensial
Perbedaan kecepatan distribusi komponen-komponen cairan berdasarkan perbedaan koefisien partisi

2. Distribusi Partisi
Perbedaan distribusi komponen-komponen suatu cuplikan diantara fasa gerak dan fasa diam karena adanya perbedaan kepolaran

3. Kecenderungan kation-kation untuk membentuk kompleks klor anionic yang stabil dalam medium asam (HCl 2M) ,seng membentuk kompleks klor anorganik yang stabil sedangkan magnesium tidak

4. Titrasi Kompleksometri
Metode analisa berdasarkan reaksi pembentukan senyawa kompleks antara ion logam sebagai atom pusat dengan zat pembentuk kompleks (ligan)

III. REAKSI

1. Standarisasi Zn2+ oleh larutan baku Na2EDTA
-ZN2+ (aq) +EBT (s ) = ZnEBT(aq) (merah anggur)
-ZnEBT (aq) +Na2EDTA (aq) = ZnEDTA (aq) +Na2EBT(aq) (biru)

2. Penentuan konsentrasi Zn2+ dan Mg2+
-Mg2+ (aq) + EBT (S) = MgEBT (aq) (merah anggur)
-MgEBT (aq) + Na2EDTA (aq) = MgEDTA(aq) + Na2EBT(aq) (biru)
-ZN2+ (aq) + EBT (s ) = ZnEBT(aq) (merah anggur)
-ZnEBT (aq) +Na2EDTA (aq) = ZnEDTA (aq) +Na2EBT(aq) (biru)

3. Kromatografi penukar ion
-ZN2+ (aq) +HCl (aq) = ZnCl3- (aq)
-ZnCl3- (aq) + Resin –N+R3Cl- = Resin –N+R3ZnCl3 +Cl-(aq)
-HNO3 (aq) + Resin –N+R3ZnCl3 = Resin –N+RNO3- +HCl (aq) +ZnCl (aq)
-Mg2+ (aq) + HCl (aq) (TDK BEREAKSI)

KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

Mekanisme : Cairan – padatan
Kekuatan ikatan elektrostatistika antara zat bermuatan

Definisi : Penukar ion adalah elektrolit yang larut dalam air yang dapat menukar ion dengan elektrolit terlarut

Struktur : Tiga dimensi, cross linking, gugus fungsional terikat pada polimer tinggi.
Contoh: divynil benzen (8%).

Exchange capacity : Jumlah total ekuivalent dari proton yang dapat diganti per satuan volume.

Resin penukar ion lemah : kapasitas adalah fungsi pH
Pemisahan penukar ion berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resin.

Jika senyawa terlarut berinteraksi lemah dengan adanya ion fasa gerak.
ion terlarut keluar awal pada kromatogram.

Sedangkan adanya senyawa terlarut yang berinteraksi kuat dengan resin ,berarti lebih kuat dan keluar belakangan.

Penukar Anionik
kelompok gugus fungsi basa
kuat : amina tersier, amonium kuarterner
lemah : amina sekunder, amonium tersier


Sifat – Sifat Penting Resin :
1. Kebesaran partikel à kecepatan pertukaran
2. Derajat cross-linking à kekakuan, pengembangan
3. Sifat dari gugus fungsional à macam ion yang ditukar
4. Kekuatan gugus fungsional à koefisien distribusi
5. Banyaknya gugus fungsional à kapasitas resin

Syarat-syarat dasar suatu resin :

1. Resin itu harus cukup terangkai silang, sehingga kelarutannya dapat diabaikan
2. Resin itu harus hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui strukturnya dengan laju yang terukur
3. Harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai dan harus stabil
4. Resin yang sedang mengembung ,harus lebih besar rapatannya daripada air
nR-H+ + Mn+ = (R-)nMn+ + nH+
R = matriks resin

Pemisahan Penukar ion :

fasa gerak : ion dengan afinitas resin rendah
elusi : gradien, bertahap, dan complexing

Afinitas Ion-ion :
Li+ < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+ < Ag+ < Tl+
Be2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Co2+ < Cu2+ < Cd2+ < Ni2+ < Ca2+ < Sr2+ < Pb2+ < Ba2+
Na+ < Ca2+ < La3+ < Th4+
OH-,F- < CH3CO2- < HCO2- < H2PO4- < HCO3- < Cl- < NO2- < HSO3- < CN- < Br- < NO3- < HSO4- < I-

VI. PROSEDUR
1. Standarisasi Na2EDTA dengan larutan baku primer

25 mL larutan ZnSO4
-masukan dalam Erlenmeyer
-encerkan sampai 50 mL
-tambahkan 5 mL dapar amoniak pH 10
-tambahkan 10 mg indicator EBT
-titrasi dengan Na2EDTA
hasil (merah anggur jadi biru)


2. Penyiapan resin

10 gram resin
-campurkan dengan 200 mL akuades dalam beaker glass
-diaduk
-dekantasi
-ulangi sampai resin bebas pengotor
-pindahkan kekolom yang telah diisi akuades
-jaga kolom resin selalu terendam akuades
-kondisikan kolom
-alirkan dua kali 25 ml HCl 2M dengan kecepatan alir 5ml permenit
hasil (kolom resin siap dipakai)

3. Pemisahan Mg2+ dan Zn2+

sampel
-masukkan dalam kolom resin
-alirkan 50 mL HCl 2M
-tampung eluat dalam Erlenmeyer (Mg2+)
-elusi kompleks Zn2+ dengan 30 mL akuades dan 80 mL HNO3 0,25 M
-tampung dalam Erlenmeyer lain
hasil (eluat)

4. Penetuan konsentrasi

eluat
-netralkan dengan NaOH
-titrasi dengan larutan EDTA
-gunakan buffer amoniak pH 10
-tambahkan indicator EBT

(volume pada buret diketahui)
-hitung konsentrasi
-hitung milligram Mg dan Zn
hasil (Miligram Mg dan Zn diketahui)

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA "ISOLASI, AMPLIFIKASI, DAN KARAKTERISASI FRAGMEN D-LOOP DNA MITOKONDRIA DARI SEL DARAH MANUSIA"

ISOLASI, AMPLIFIKASI, DAN KARAKTERISASI FRAGMEN D-LOOP DNA MITOKONDRIA DARI SEL DARAH MANUSIA


ABSTRAK


DNA mitokondria adalah sistem genetic yang berbeda dengan DNA inti, setiap mitokondria umumnya mempunyai dua enzim kopi mt-DNA. DNA mitokondria juga memiliki urutan nukleotida non-penyandi yang disebut dengan D-loop. Pada D-loop terdapat titik awal proses replikasi dan darah promoter transkripsi. Pada percobaan ini dilakukan amplifikasi fragmen daerah D-loop mt-DNA manusia dari sel darah putih dengan teknik PCR. Setelah diisolasi dan diperbanyak, DNA ini dianalisis dengan metode elektroforesis. Pengisolasian mt-DNA dilakukan dengan cara lisis sel, sebelumnya sel darah putih dipisahkan dari komponen darah lainnya dengan menggunakan buffer TE. Pemecahan sel dilakukan dengan penambahan buffer lisis (Tris-HCl, tween-20, dan EDTA) dan enzim proteinase K. Setelah mt-DNA diperoleh dilakukan proses amplifikasi dengan teknik PCR dengan penambahan master mix dengan melalui 3 tahap utama yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi sebanyak 30 siklus. Analisis fragmen DNA mitokondria dilakukan dengan metode elektroforesis agarosa, dengan penambahan loading buffer, pergerakan DNA akan terlihat jelas. Untuk melihat hasil elektroforesis, gel disinari UV.


ABSTRACT


DNA Mitochondria is different system genetic by DNA nucleus, each mitochondria generally have two enzyme copy the mt-DNA. DNA Mitochondria also own the sequence of nucleotida non-penyandi is so-called by D-Loop. At D-Loop there are starting points process the replication and blood of promoter transcription. This experiment is done amplification fragment area of D-Loop mt-DNA of human being from leuchocyte with the technique PCR. After insulation and multiplied, this DNA is analysed with the method electrophoresis. Insulation Mt-DNA done by lisis cell, previous of phabocyte locked out of an other blood component by using buffer TE. Cell Resolving done with the addition of buffer lisis ( Tris-HCl, tween-20, and EDTA) and enzyme proteinase K. After mt-DNA obtained to be done by process amplification with the technique PCR with the addition of master mix through 3 especial phase that is denaturation, annealing, and elongasi as much 30 cycle. Analyse the fragment of DNA mitokondria done with the method of electrophoresis agarosa, with the addition of loading buffer, movement DNA will be stand-out. To see the result elektroforesis, gel illuminated by UV.


ISOLASI, AMPLIFIKASI DAN KARAKTERISASI FRAGMEN D-Loop DNA MITOKONDRIA SEL DARAH


I. TUJUAN
1. Mengisolasi DNA mitokondria dari sel darah dengan metode lisis sel
2. Mengamplifikasi daerah D-loop DNA mitokondria secara invitro dengan teknik PCR
3. Mengkarakterisasi fragmen DNA hasil PCR dengan metode elektroforesis gel agarosa 1%.

II. PRINSIP
1. Lisis sel
Pemecahan membrane sel atau dinding sel dengan menggunakan buffer lisis
yang bertujuan untuk mengisolasi DNA mitokondria dari sel.
2. Teknik replikasi DNA secara invitro
Teknik perbanyakan suatu fragmen DNA yang terletak diantara dua daerah DNA
yang sudah diketahui urutannya yang dilakukan diluar sel.
3. Elektroforesis
Pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan ukuran dan muatan partikel dengan
adanya energi listrik.

III. TEORI

Semua makhluk hidup memiliki materi genetic untuk mempertahankan kelangsungan struktur, sifat, fungsi dan aktivitas-aktivitas kimia dalam selnya. DNA merupakan salah satu jenis asam nukleat yang berperan sebagai materi genetic yang menurunkan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi turunannya. Materi ini mengarahkan pembentukan protein dan RNA tertentu yang penting dalam sel makhluk hidup. DNA juga mengatur pertumbuhan dan pembelahan sel, termasuk informasi untuk diferensiasi sel sehingga terbentuk tumbuhan, hewan, manusia dan mikroorganisme lainnya. Begitu pentingnya DNA ini sehingga disebut sebagai molekul utama kehidupan (Wirahadikusumah, 1985).

DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu. DNA alami terdiri dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks ganda. Basa A-T dan G-T yang saling komplementer tersusun berpasangan melalui ikatan hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982).

DNA akan mengalami denaturasi dan renaturasi. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau diberi alkali kuat, maka hubungan hydrogen menjadi labil dan putus. Dua pita spiral dari molekul DNA itu membuka. Proses ini disebut denaturasi DNA. Jika larutan tersebut kemudian didinginkan kembali atau dinetralisis secara perlahan-lahan maka terbentuklah pasangan-pasangan basa itu kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi.

Molekul DNA juga dapat mengalami replikasi. Ada tiga cara replikasi molekul DNA, yaitu secara:

1. Semi konservatif
Dua pita spiral dari `double helix` memisahkan diri. Tiap pita tunggal dari 'doublehelix' parental ini berlaku sebagai pencetak (model) untuk pembentuk pita pasangan yang baru.

2. konservatif
Double helix parental tetap utuh, tetapi keseluruhannya dapat mencetak double helix baru.

3. Dispersif
kedua buah pita dari double helix parental terputus-putus. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA yang dibentuk baru saling bersambungan dan menghasilkan dua double helix baru(Jack,1995).

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil.

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°.Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel disembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3 Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase,proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C. Durasi tahap ini biasanya 1menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1.
Tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.

Proses PCR berlangsung dalam beberapa siklus. Kisaran sikllus optimum dalam proses PCR adalah 30-35 siklus, bergantung pada enzim polymerase, jumlah templat. Beberapa komponen yang diperlukan untuk prosese PCR adalah alat PCR (DNA Thermal Cycler) dan bahan-bahan seperti : DNA sampel yang akan diamplifikasi, dNTP, oligonukleotida primer (nukleotida pendek untuk mengawali reaksi polimerisasi), enzim DNA polymerase untuk mengkatalisis reaksi pemanjangan primer, ddH2O serta buffer PCR sebagai pelarut baham-bahan.Hasil akhir proses PCR disebut amplikon(Toha, 2001).

Sampel darah dapat digunakan secara luas untuk diagnosis yang menggunakan teknik PCR. Ketika menggunakan teknik amplifikasi sampel darah, kapasitas amplifikasi dapat berkurang secara dramatis atau terhalang oleh adanya senyawa inhibitor PCR. Metode tradisional untuk menghilangkan eritrosit dari sampel darah termasuk isolasi selektif leukosit, utamanya limfosit atau buffer pelindung menggunakan gradient densitas/prosedur sentrifugasi. Hal ini umumnya diikuti dengan lisis sel darah putih dengan kehadiran deterjen anionic dan protease, ekstraksi multiple fenol/kloroform, dan pengendapan etanol untuk mengambil kembali DNA.
DNA mitokondria sel limfosit pada umumnya sama dengan DNA mitokondria sel lainnya. DNA mitokondria pada umumnya berbentuk sirkular(siklik), rantai ganda dan merupakan superkoil kecuali DNA mitokondria di dalam Tetrahymena dan Paramecium berbentuk linier. DNA mitokondria manusia mengandung gen-gen 125 dan 165 rRNA, 22gen tRNA dan 13 gen polipeptida (Toha, 2001).

Jenis replikasi inisiasi yang menarik terlihat pada sel DNA mitokondria. Replikasi tidak langsung dari 16-kb sirkuler rangkap dimulai dari origin dalam suatu untai (untai L). Sebagai permulaan replikasi, untai induk H (heavy) digantikan oleh untai H berkembang membentuk struktur yang disebut displacement Loop atau D-Loop yang dapat dilihat secara langsung telah menghasilkan dua-tiga perputaran dalam lingkaran, dan origin untai H dibuka dalam untai yang digantikan, dan replikasi tak langsung dari origin awal yaitu dari replikasi untai H secara langsung. Proses ini membutuhkan waktu sekitar 1 jam, waktu ini lebih lambat untuk replikasi pada eukariotik dibandingkan DNA prokariotik (Mathew and Van Hold, 1983).

Sentrifugasi merupakan salah satu teknik yang penting dalam biokimia. Teknik ini selain dapat digunakan untuk pemisahan material juga dapat digunakan untuk mempelajari sifat-sifat fisik dari molekul. Pada dasarnya sentrifugasi dilakukan dengan menenmpatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu medan gaya sentrifugal. Dalam operasinya sentrifugasi dijalankan dengan menaruh partikel dan medium suspensinya dalam suatu tabung yang ditempatkan pada ujung dari alat yang berputar yaitu rotor (Bloom, 2000).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan yang didasari migrasi molekul di dalam medan listrik. Tingkat migrasi tergantung dari kekuatan medan listrik, bersama dengan muatan , ukuran dan konformasi molekul dan kekuatan ionic.Viskositas dan temperature medium tempat perpindahan molekul. Inhibitor nuclease dimasukkan ke dalam prosedur elektroforesis untuk mencegah degradasi asam nukleat selama elektroforesis. Contohnya adalah EDTA, dimana EDTA membentuk khelat kation divalen dengan nuclease sehingga nuclease menjadi terdeaktivasi dan membutuhkan aktivitas ribonuklease. Agarosa digunakan untuk proses elektroforesis. Agarosa merupakan gel yang kuat yang dapat membentuk saringan seperti matriks akrilamida. Gel ini digunakan untuk memisahkan asam nukleat dan memiliki keuntungan yaitu sangat mudah dibuat.Agarosa dilelehkan dalam buffer pilihan dan dituangkan sebagai gel marmer. Pemilihan matriks gel dan konsentrasi gel tergantung asam nukleat yang dipisahkan dan kondisi yang digunakan selama asam nukleat tersebut (Holme, 1993).

Molekul DNA yang berukuran kecil dapat dengan mudah melalui pori-pori gel, sehingga pergerakannya menjadi relative lebih cepat. Sebaliknya molekul DNA yang berukuran besar karena sulit melewati pori-pori gel maka akan bermigrasi lebih lambat.

DNA yang mempunyai ukuran yang sama, tetapi mempunyai konformasi yang berbeda, akan bergerak dengan kecepatan berbeda.DNA denagn konformasi siklik akan lebih mudah melewati pori-pori geldibandingkan dengan DNA konformasi linier. Proses elektroforesis yang menggunakan buffer dengan kekuatan ion yang rendah akan menyebabkan pergerakan DNA relative lambat (Toha, 2001).


IV. ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat
• Alat elektroforesis
• Batang pengaduk
• Beaker glass
• Botol reagent 15 ml
• Freezer/pendingin -20oC
• Gunting
• Inkubator 55oC dan 95oC
• Kertas saring
• Mikropipet 10, 25, 100, dan 1000 µL
• Mikrosentrifuga
• Tabung mikro
• Thermal Cycler (alat PCR)

4.2 Bahan
• Aquabiddest
• Agarosa
• Buffer lisis (tris-HCl 50mM pH 8,5 + Tween-20 0,5% +EDTA 1mM pH 8)
• Buffer PCR (tris-HCl 100mM pH 9 +KCl 500mM +MgCl2 15mM)15µL
• Cuplikan hasil lisis sel 10µL
• dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
• Etanol 70%, 10ml
• Etidium bromida
• Primer M1 = 5’ AGG ACA AGA GAA ATA AGG 3’ dan M2 = 5’ TGG CCA TGG GTA TGT TGT 3’ 60 pmol
• Proteinase K 20mg/ml; 2µL
• Sampel darah
• Standar DNA PVC 300 mg
• Standar templat mt-DNA (control positif) 10 μl

V. PROSEDUR

A. Penyediaan sampel mtDNA sebagai template PCR

A.1 Lisis sel darah putih (limfosit)

Sel darah manusia sebanyak 200 μl dimasukkan ke dalam tabung mikro, dicuci dengan 500 μl buffer TE, kemudian dihomogenkan dengan alat vortex dan disentrifugasi pada 14.000 rpm, supernatant dibuang. Endapan lalu dicuci lagi dengan buffer TE dan dilakukan hal yang sama sampai diperoleh warna putih. Lalu ditambakan buffer lisis 10 μl buffer lisis, 6 μl protease K dan 174 ddH2O. Kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu 560C selama 1 jam, lalu diinaktivasi pada suhu 90-950C selama 5 menit dalam waterbath. Sentrifugasi ekstrak gel dalam tabung pada suhu kamar dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dapat disimpan pada -200C.

B. Mekanisme PCR

B.1 Pembuatan master mix

Aquabiddest sebanyak 13,4 μl ditambahkan dengan buffer DNA polymerase 2,5 μl; MgCl2 2,5 μl; dNTP 0,5 μl; primer M1 dan M2 masing-masing 0,5 μl; DNA polymerase 0,1 μl; DNA template 5 μl. Kemudian divortex agar semua komponen tercampur.

B.2 Reaksi PCR

Sementara itu dapat disiapkan 3 tabung mikro yang masing-masing berisi 5 μl standar (tabung 1), 5 μl sampel hasil lisis (tabung 2) dan kontrol positif yang berisi templat mtDNA (tabung 3). Kedalam tabung masing-masing ditambahkan master mix. Lalu disentrifugasi selama 1-3 detik untuk mengumpulkan campuran reaksi didasar tabung. Ketiga tabung disimpan dalam serbuk es sementara menunggu set-up mesin PCR(Thermal Cycler).
Set-up mesin PCR(Thermal Cycler) untuk 30 siklus dengan masing-masing siklus terdiri atas:
- Tahap denaturasi template = 940C, satu menit
- Tahap penempelan primer = 500C, satu menit
- Tahap perpanjangan primer = 720C, satu menit
- Tahap pengkondisian sebelum masuk siklus pertama = 940C, dua menit
- Tahap pemantapan setelah selesai siklus w-30 = 720C, empat menit
Ketiga tabung distabilkan didalam mesin PCR kemudian start reaksi PCR.

B.3 Pembuatan gel agarosa
Agarosa ditimbang sebanyak 0,3 gram dan dimasukkan ke dalam beaker glass. Kemudian ditambahkan 30 ml buffer TAE dan dipanaskan sampai larut sambil diaduk. Setelah larut, didinginkan pada suhu 50-600C. kemudian ditambahkan 2 μl etidium bromide. Larutan agarosa dituangkan ke dalam cetakan gel berbentuk sisir, sehingga terbentuk sumur-sumur gel.

B.4 Elektroforesis
Sebanyak 10 μl sampel hasil PCR ditambahkan dengan 2 μl loading buffer (dipipet naik turun pada parafilm). Setelah itu, campuran dituang ke dalam sumur gel yang telah direndam buffer TAE. Jalankan elektroforesis dengan V 75 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan sinar UV.



VII. PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi, mengamplifikasi, dan mengkarakterisasi DNA mitokondria dari daerah D-Loop dari sel darah putih (leukosit). Isolasi DNA mitokondria dilakukan dengan cara lisis sel. Sel yang digunakan adalah sel yang memiliki banyak organel mitokondria yang ditandai dengan aktivitas sel yang sangat tinggi karena tersedianya ATP yang cukup. Aktivitas ini dapat berupa seringnya sel membelah diri untuk beregenerasi. Leukosit juga merupakan sel yang daya regenerasinya tinggi.

Mitokondria hanya terdapat dalam eukariotik. Struktur mitokondria bervariasi dalam ukuran, bentuk, jumlah dan lokasi tergantung spesies sel. Mitokondria merupakan pabrik energi sel. Organel ini mengandung berbagai enzim yang secara bersama-sama mengkatalisis oksidasi zat makanan organik oleh molekul oksigen untuk menghasilkan CO2 dan H2O. Sejumlah energy kimia dibebaskan selama oksidasi ini yang dipergunakan untuk menghasilkan adenosine triposphat (ATP) yang merupakan suatu molekul pembawa energy utama sel . ATP yang dibentuk oleh mitokondria berdifusi ke bagian sel untuk melangsungkan kerja satu sel.

Darah yang berfungsi sebagai alat angkut O2, CO2, sari-sari makanan, hormone, dan zat hasil ekskresi terdiri dari dua bagian utama, yaitu plasma darah (bagian cair di dalamnya terlarut berbagai zat yaitu protein plasma, nitrien, garam-garam mineral seperti HCO3, SO42-, Cl-, Ca2+, gas seperti O2, N2, dan CO3 serta zat-zat metabolism seperti asam urat, urea dan enzim serta hormone). sedangkan sel (bagian padat) terdiri dari sel darah merah (erttrosit),sel darah putih (leukosit) dan keping pembuluh darah( trombosit). Sel darah merah bikonkaf tidak berinti sebagian besar organal sitoplasma sehingga seluruh isi sel rongga intraseluler di isi Hb, yaitu suatu protein yang menyebabkan darah berwarna merah. Sel darah putih terdiri dari sel darah yang berganda (granulosit), yaitu neotrophil, basophil dan eosinophil, dan sel yang tak bergranula (agranulosit) , yaitu limfosit dan monosit. Sel darah putih ini mempunyai inti, dapat bergerak bebas, amoeboit, dan dapat menembus pembuluh darah, berfungsi untuk membunuh kuman dengan cara fagositosis. Setiap 1mm3 darah mengandung 6000-9000 leokosit.

Sel darah putih inilah yang digunakan DNA mitokondrianya sebagai DNA template. Sel erittrosit tidaj dapat digunakan sebagi sumber DNA mitokondria karena sel darah merah mengandung ion Fe2+ dalam tiap molekul molekul hemoglobin(Hb) dan tiap Fe2+ dilelilingi unit forfirin. Sehingga hemoglobin adalah penyusun erittrost tiap hemoglobin bereaki enpat molekul dioksigen untuk membentuk oksihemoglobin sehingga o2 dapat diangkut ke seluruh bagian tubuh. Adanya fe2+ pada eritrosit akan mengganggu enzim polimerasi pada proses PCR(fe2+ merupakan inhibitor enzim polymerase)sehingga walaupun eritrosit memiliki mitokondris dalam jumlah banyak yang ditandai dengan sering sel membelah, tapi tidak digunakan dalam DNA templat. Sedangkan trombosit tidak digunakan karena jumlah sedikit, bentuknya tidak beraturan, dan yang paling menetukan adalah sel ini mudah sekali pecah sehingga sulit di isolasi.

Untuk memisahkan sel darah putih dari komponen penyusun darah lainnya digunakan larutan pencuci buffer TE yang terdiri tris HCl dan EDTA. Sel darah merah dan trmbosit serta plasma darah larut dalam buffer TE sedangkan leukosit tidak.eritrosit larut karena terbentuknya kompleks antara Fe2+ dalam eritrosit dengan EDTA. Perbedaan kelarutan ini menyebabkan leukosit berada sebagai endapan sedangkan komponen lainnya sebagai supernatan. Supernatan ini dibuang ke dalam lysolsebagai disinfektan, sedangkan endapan yang mengandung leukosit yang tidak larut dalam buffer TE dicuci lagi dengan buffer TE, dihomogenkan menggunakan vorteks agar interaksi komponen darah dengan buffer TE sempurna. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm. Setelah dicuci lima kali dengan menggunakan buffer TE, sel leukosit ini susah bebas dari eritrosit yang akan mengganggu proses selanjutnya.

Darah yang digunakan diambil dari seorang donor. Darah yang diambil ini tidak boleh sampai membeku, yaitu dilakukan dengan jalan mendinginkan darah mendekati titik bekunya. Hal ini bertujuan untuk menghalangi pembentukkan thrombin yang berperan dalam pembakuan darah, dapat juga dengan member garam natrium oksalat atau natrium sitrat yang bertujuan mengendapkan ion kalsium sehingga pengubahan protein ini menjadi terhambat atau dapat dengan penambahan heparin yang merupakan zat anti koagulan atau anti pembekuan darah, atau dapat juga mencegah persentuhan dengan permukaan yang kasar, misalnya menggunakan alat dengan sel darah yang tajam dan permukaan alat licin dan halus yaitu menggunakan jarum suntik.

Sel leukosit ini dicuci menggunkan buffer lisis, proteinase K dan ddH2O. Buffer lisis terdiri dari tris HCl pH 8.5, EDTA pH 8, dan 0,5 % tween-20. Tris HCl berfungsi sebagai pengkondisi pH optimum dari reaksi enzimatik oleh enzim proteinase K. Setiap enzim memiliki pH spesifik dimana dia akan bekerja maksimum. Di bawah atau di atas pH ini enzim akan terdenaturasi karena akan mendekati titik isoelektriknya. Kelarutan protein disebabkan oleh adanya muatan pada gugus sampingnya yang berinteraksi dengan atom oksigen yang bermuatan parsial negative dan atom hydrogen yang parsial bermuatan pada molekul air. Karena tidak adanya muatan maka protein tidak larut dan mengendap.

EDTA berfungsi sebagai pembentuk khelat kofaktor enzim nuclease Mg2+. Enzim nuclease ini terdapat dalam sel pada bagian organel lisosom, dan pada saat sel pecah, lisosom juga pecah sehingga mengakibatkan semua enzim yang terdapat di dalam keluar termasuk nuclease. Nuklease ini siap untuk memfragmentasi DNA menjadi segmen fragmen kecil. Tetapi karena kofaktor yang menyebabkan enzim tersebut dapat melaksanakan aktivitasnya sudah membentuk khelat dengan ESTA, maka enzim nuclease ini tidak berfungsi. EDTA meruypakan enzim polidentak dengan 6 pasang elektron bebas membentuk cicin khelat dengan ion logam. Senyawa kompleks ini stabil dan sukar dilepas. Tapi penambahan EDTA tidak boleh berlebihan, jumlah EDTA yang terkandung dala buffer lisis adalah jumlah yang optimum. Jika EDTA terlalu banyak akan mengganggu aktivitas rnzim polymerase pada proses PCR Karena akan mengkhelat kofaktor ini yaitu Mg2+.

Proteinase K adalah enzim yang memotong protein. Enzi mini mengenal asam am ino yang bermuatan positif, bermuatan besar, dan mempunyai gugus OH, misalnya tirosin. Proteinase memotng protein yang menyusun membrane baik membran sel dan membran mitokondria. Tiap mitokondria mempunyai 2 sistem membran. Membran luar bersifat licin mengelilingi keseluruhan mitokondria. Membran sebelah dalam berlipat-lipat disebut sebagai krista (crystae). Bagian dalam mitokondria teris oleh suatu matriks yang menyerupai gel. Mitokondria mengandung sejumlah kecil DNA, RNA, dan ribosom. DNA mitokondria memberikan sandi bagi sintesa protein spesifik tertentu pada membrane dalam.

Komponen utama membran adalah lipida polar dan protein.Bagian lipida membran tersusun atas suatu campuran berbagai jenis lipida polar atau amfipatik. Mengandung terutama fosfogliserida, dan spingolipida dalam jumlah sedikit. Triasilgliserol terdapat dalam jumlah sangat kecil di dalam membran. Beberapa sel mengandung kolesterol dan ester kolesterol dalam membrane dalam jumlah cukup banyak. Khususnya pada membrane sebelah luar. Protein pada membran menyusun 20-80 % massa membran. Membran sel dalam mengandung kurang lebih 20 jenis protein, sedangkan membrane sebelah dalam mitokondria mengandung jumlah protein dalam jumlah besar. Beberapa protein pada membrane adalah enzim yang lain berfungsi untuk mengikat dan mengangkut molekul polar melalui membran.

Proteinase ini akan memecah protein membran baik protein ekstrinsikatau pheriperal yang tidak terikat kuat pada permukaan membran dan protein intrinsic atau protein integral yang terbenam dalam struktur membran bahkan memanjang sepenuhnya menembus membran.

Sementara proteinase K memotong-motong protein, tween-20 menggangu integritas fosfolipid dan protein hidrofobik.Penyusun utama membran tween-20 merupkan detergen yang mempunyai gugus hidrofobik dan hidrofilik. Gugus hidrofilik akan menghadap ke air, sedangkan gugus hidrofobik dengan lipid pada lipoprotein sehingga lipoprotein berfragmentasi. Hasil kerja dari proteinase K yang berupa potongan-potongan protein dari membran dan hasil kerja twee-20 berupa lipid yang terikat pada gugus hidrofobiknya kemudian diemulsikan oleh tween-20 sehingga memudahkan pembentukan endapan hasil pemecahan sel.

Setelah penambahan buffer, kelarutan diinkubasi pada 50 0C yang merupakan suhu optimim pada proteinase K, suhu di mana aktivitas enzim ini maksimum sehingga dapat memecah protein membrane sehingga DNA mitokondria dapat diisolasi. Untk menginaktifan enzim proteinase K ini, larutan diinkubasi pada 90 0C selama 5 menit. Pada suhu tinggi enzim akan terdenaturasi sehingga kehilangan aktivitasnya. Enzi mini harus diinaktifkan karena jika masih ada enzim proteinase maka akan memfragmentasi enzim Taq-polimerase yang sangat berperan dalam proses PCR.

Kemudian larutan ini disentrifugasi pada suhu kamar dengan kecepatan 14.000 rpm. Kecepatan ini dalah kecepatan optimum. Kecepatan yang terlalu besar dan waktu yang terlalu lama akan menimbulkan panas yang akan mendenaturasi DNA template. Kecepatan yang lebih rendah tidak efektif karena tidak terjadi pemisahan yang sempurna. Dengan prinsip pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan sedimentasi dalam suatu medan sentrifugal, maka dengan sentrifugasi ini partikel-partikel yang lebih besar akan terendapkan sedangkan partikel kecil tidak dan berada sebagai supernatant. Medan sentrifugal menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat kea rah luar dari sumbu rotasi. Hasil lisi berupa potongan-potongan membran dan organel-organel, DNA inti dan DNA mitokondria akan terpisah. DNA mitokondria yang mempunyai berat molekul lebih kecil akan berada dalam supernatant sedangkan DNA inti dan komponen sel lainnya akan terendapkan karena mempunyai berat molekul yang lebih besar. Sentrifugasi dapat digunakan untuk memisahkan DNA mitokondria dengan DNA inti. DNA mitokondria hanya memiliki 16.569 pb sedangkan DNA inti 3 milyar pb.
Siklus dipisahkan, supernatan yang mengandung mt-DNA disimpan pada freezer suhu -20 untuk mencegah dinaturasi. mt-DNA ini digunakan untuk sebagai templat DNA. Genun mitokondria berukuran 16.569 pb dan terdiri atas gas-gas penyadi r-RNA 12 s dan 16 s, 22 tRNA dan 13 protein subunit kompleks enzim rantai respirasi. Yang diam pipfikasi adalah darah D-loop yang merupakan urutan mitokondria penyandi, merupakan daerah hipervariabel dan titik awal proses replikasi dan daerah promotor transkripsi. Pada percobaan ini dilakukan amplifikasi fragmen 0,4 kb daerah D-loop mt-DNA sel darah putih dengan teknik PCR.

Komponen yang disiapkan untuk proses PCR adalah antara lain primer, buffer PCR, dNTP, standar templat mt-DNA (control positif) hasil lisis dan aquabidest steril. Primer merupakan oligonukkonda tunggal. Syarat primer diantaranya adalah persentase GC minimal 50%, supaya ikatan dengan DNA templat kuat akibat ikatan hidrogennya 3 antara basa nitrogen G-C. karena makin kuat kekuatan penempelan (annialing) dapat dengan permukaan loop akibat ada urutan nukleotida yang berulang.
Untuk mendapatkan primer kita harus tahu dahulu urutan nukleutida DNA templat. Primer yang repentitif dan kompetitif harus dihindari karena jika repetitive akan terbentuk harpin (Ω) sehingga proses penempelan ke templat tidak akan maksimal. Primer juga harus memiliki basa G dan C pada ujung 3’ supaya ikatannya kuat karena 3 ikatan hydrogen yang dibangunnya. Primer yang digunakan adalah M1 = 5’ CAC CAT TAG CAC CCA AAG CT 3’ dan M2 = 5’ CAT TTC ACG GAG GAT GT GC 3’, panjang primer biasanya 16.30 pb. Kedua primer ini memiliki suhu melting nasing-masing 580C dan 600C. kedua suhu ini relative dibuat sehinga dapat digunakan suhu annealing yaitu 500C. Suhu melting adalah suhu dimana solat DNA terdiri turasi sebanyak 50%, suhu annealing dibawah suhu melting ini (Tm). Suhu annealing berada dibawah Tm agar primer menempel pada templat pada posisi yang tepat. Kalau Tm berbeda jauh maka primer akan memenpel pada templat pada posisi yang berbeda-beda. Pada suhu dibawah suhu annialing seharusnya maka dlian terdapat lebih dari 1 fragmen dan primer menempel pada tempat yang tidak spesifik. Jika ini terjadi maka suhu dinaikan agar fragmen yang tidak memiliki homologi 100% terdenaturasi. Jika suhu lebih tinggi dari suhu annialing sebenarnya, maka primer tidak akan menempel di templat karena cenderung terdenaturasi ikatan hydrogennya.

Komponen lain PCR adalah dNTP (deoxinukleutida tripospat) yang terdiri atas dNTP, dTPP, dGTP, dan dCTP. Sebagian sumber untuk memperpanjang primer (proses elungasi). Standar templat mt-DNA berfungsi sebagai control positif untuk megetahui apakah proses PCR berjalan benar atau tidak, sedangkan aquabidest untuk kontrol negatif untuk mengetahui apakah ada pengotor atau tidak dalam proses elektroforesis.
Proses PCR terdiri dari 3 tahap utama yang diulang 30 siklus.

Tahap pertama adalah denaturasi rantai ganda DNA terbuka menjadi rantai tunggal karena terputusnya ikatan hydrogen dari DNA, dan pada suhu in semua reaksi enzimatis berhenti misalnya perpanjangan dari siklus sebelumnya jika reaksi PCR telah berjalan.

Setelah rantai DNA terbuka, suhu diturunkan untuk penempelan primer tapi tetap dijaga agar pada suhu tersebut rantai DNA tetap tunggal, karena itu suhu annialing + 50C dibawah suhu melting (Tm) yaitu 500C. Pada suhu ini primer bergerak acak berkeliling disebabkan oleh gerak brown. Ikatan hidrgen terbentuk secara konstan antara rantai yunggal primer dengan rantai tungal DNA templat. Diperlukan waktu agar sedikit lama untuk membentuk ikatan yang lebih kuat, tapi saat bebrapa masa dari dNTP sudah mulai terikat pada rantai primer yang merupakan komplemen templat maka ikatannya akan kuat dan tidak mudah putus.

Setelah templat ditempeli primer, enzim polymerase mulai bekerja, tapi agar enzim ini bekerja maksimal maka suhu harus dinaikan menjadi 720C yang merupakan suhu optimum Tag-polimerase. Primer yang ditambahkan oleh beberapa basa (dNTP) memiliki gaya tarik lebih kuat dengan templat karena adanya ikatan hydrogen daripada gaya untuk memutuskanikatan tersebut. Primer yang berada pada posisi tidak seharusnya akan terlepas dari templat (karena suhu yang lebih tingi sehingga tidak mengalami perpanjangan fragmen). Basa dNTP yang komplimen terhadap templat berikatan dengan primer paa sisi 3’ membentuk ikatan fosfodiester. Gugus –OH pada primer akan berikatan dengan gugus fosfat pada dNTP.

Sebelum masuk ke siklus selanjutnya ada tahap pengkondisian sebelum masuk siklus denaturasi yaitu pada suhu 940C selama 1 menit dan pada akhir siklus ada tahap pemantapan yaitu pada suhu 27 ºC selama 4 menit. Pada proses ini terjadi kenaikan dan penurunan yang cukup drastis secara cepat, hal ini dimungkinkan terjadi pada PCR adalah bagian dengan suhu tertinggi yaitu untuk mencegah kondensasi pada waktu penurunan suhu

Buffer PCR yang digunakan terdiri dari Tris HCl PH 9, KCl, dan MgCl2. digunakan buffer PH 9 karena kondisi ini merupakan PH optimum bagi Enzim Tag-polimerase, Mg2+ deperlukan sebagai Ko-faktor sehingga Enzim Tag-polimerase dapat menjalankan aktivitasnya dengan baik. Adanya KCl untuk menciptakan kondisi larutan dengan konsentrasi garam tertentu.

Enzim polimerase digunakan untuk memperpanjang primer dengan bantuan faktor Mg2+. Sumber DNA polimerase yang lain adalah Vm polimerase. DNA polimerase ini membaca baca yang ada di DNA template dan mendatangkan basa dNTP yang sesuai, yaitu komplemen dan template.

Pada saat pembentukan master mix, DNA Taq polimerase ditambahkan paling akhir, hal ini untuk menghindari pengurangan aktivitas dari enzim polimerase tersebut. Enzim sangat sensitif, pada suhu tertentu akan mengalami pengurangan aktivitas sampai setengahnya. Maka untuk mempermudah aktivitas maksimum, enzim ini ditambahkan paling akhir karena langsung ditambahkan ke substrat sehingga enzim tidak mengalami gangguan atau perubahan yang berarti akibat kondisi lingkungan, misalnya perubahan suhu menjadi suhu kamar. Konsentrasi master mix ini tertentu karena sangat berpengaruh jika konsentrasi tidak sesuai akan mengakibatkan produk samping atau tidak terbentuk penempelan primer. Pada pembuatan master mix campuran dipipet naik turun beberapa kali untuk menghomogenkan campuran reaksi dan semua reagen master mix disimpan sebelum dicampurkan, pada suhu sangat rendah di atas serbuk es agar berada dalam keadaan dingin untuk mencegah denauturasi dan kontaminasi oleh bakteri. Sebelum masuk alat PCR, tabung yang berisi sampel dan kontrol positif disentrifugasi pada mikrosentrifugasi selama 1-3 detik untuk mengumpulkan campuran reaksi di dasar tabung.

Bagian D-loop yang diamplifikasikan adalah daerah 15.978 pb – 16.920 pb.

Karena primer 1 berjumlah 21 pb maka ia akan menempel pada daerah 15.978 pb – 15.987 pb. Sedangkan polimer 2 yang berjumlah 19 pb akan menempel pada daerah 16.901 pb – 16.920 pb.

Sehingga panjang DNA yang dihasilkan adalah (16.920 pb – 15.978 pb) + 1 = 443 pb

Setelah PCR selesai maka fragmen DNA ini dianalisis dengan cara elektroforesis. Dapat dilakukan analisis dengan cara elektroforesis karena DNA memiliki muatan negatif akibat gugus fosfat yang dikandungnya sehingga dapat berpindah dalam medan listrik ke arah kutub positif. Arah perpindahan tergantung pada tanda muatan, tapi kecepatan perpindahan tergantung pada magnitude muatan dan sedimentasinya atau ukuran molekul.

Agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gr agarosa padat dilarutkan dalam 40 ml buffer TAE (tris asetat 0,04 M, EDTA 0,001 M pH 9). Larutan dipanaskan sampai semua agarosa larut, lalu didinginkan hingga suhu larutan turun kira-kira 50 – 60o C, karena kalau terlalu panas pada saat penuangan, viskositas cairan akan menurun pada suhu tinggi akibatnya akan terjadi gelembung pada gel yang mengganggu proses elektroforesis atau jika cetakan dibuat sendiri lem pada cetakan akan meleleh akibat suhu tinggi. Suhu tidak boleh terlalu rendah karena gel ini akan membeku sebelum dicetak. Agarosa ini sesuai untuk medium elektroforesis karena memiliki tingkat elastisitas tertentu dan warnanya yang transparan sehingga memudahkan pengamatan. Tidak digunakan poliakril amid walaupun memberikan tingkat pemisahan yang lebih baik karena poliakril amid ini dapat merusak urutan nukleotida sehingga DNA tidak dapat dianalisis jika prosedur diteruskan ke sequencing.

Sebelum dituangkan ke dalam cetakan, ke dalam gel agarosa ditambahkan etidium bromida 2 µL yang akan berfluoresensi di bawah sinar UV dan dapat mengikat DNA. Nama kimia EtB, adalah 3,8 – diamino, 5 – etil, 6 fenil bromida.

Cairan ini dibuat dari EtBr yang dilarutkan. Kelarutannya larut dalam etilen glikol dan sedikit larut dalam kloroform dan etanol. Senyawa ini stabil pada T dan P normal. Pada saat terdekomposisi termal senyawa ini akan melepaskan oksida beracun dari karbon dan nitrogen dan senyawa HBr yang beracun.

Cara etidium bromida ini mengkhelat DNA adalah dengan cara masuk di antasa basa-basa DNA. Ikatan ini mirip dengan lapisan pada grafit, misalnya timbunan dan cincin aromatik. EtBr dapat berikatan dengan hidrogen melalui gugus amino bebasnya dengan oksigen dan gugus fosfat pada DNA. Alasan mengapa molekul akan terfluoresens karena EtBr dapat diasumsikan sebagai pasangan basa dan masuk ke dalam rantai ganda DNA di antara pasangan basa M DNA. EtBr ini mutagen yang sangat kuat menghasilkan titik-titik mutasi. EtBr pada keadaan sendiri merupakan zat yang menghasilkan fluoresensi yang lemah. Fluoresensi terjadi karena elektron tereksitasi ke tingkatan yang lebih tinggi energinya (dalam hal ini karena disinari oleh sinar UV 3,2 nm). Ketika elektron kembali ke tingkat energi yang lebih rendah (ground state) yang merupakan kecenderungan semua molekul untuk memilih tingkat energi yang lebih rendah, dan karena ada perbedaan energi sejumlah energi dipanaskan berupa sinar tampak berpanjang gelombang tertentu yang memancarkan warna orange. Sifat fluoresens dari EtBr sendiri dalam larutan lemah karena elektron dapat mengalir antara dua tingkatan energi menggunakan energi vibrasi. Jalur alternatif ini mengurangi banyaknya elektron yang mengikuti alur fluoresensi sehingga daya fluoresnsinya rendah kalau hanya berupa EtBr tunggal. Tapi ketika EtBr terikat oleh DNA, elektron lebih mengikat kuat sehingga menghasilkan kemungkinan yang kecil untuk melalui alur vibrasi dan elektron lebih memilih melalui alur fluoresensi.

Cetakan memilki “sisir” untuk membentuk sumur gel. Sampel hasil PCR ditambahkan 2 µL loading buffer yang terdiri dari sukrosa 30 %, EDTA, bromfenol biru 0,1 µL. Sukrosa digunakan sebagai pembuat agar substrat yang dielektroforesis masuk ke dalam sumur sukrosa yang merupakan polimer dengan BM tinggi. C12H22O12 sehingga lerutan DNA akan tertarik ke bawah akibat gravitasi.


DAFTAR PUSTAKA

Bloom,M.V. 2000. Polimerase Chain Reaction. Publisher. New York.
Holme,D.J and H.Peck. 1993. Analytical Biochemistry. Second Edition. John Wiley
and Sons. New York.
Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. Oxford University
Press. New York.
Lehninger,AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M.Thenawijaya.
Erlangga. Jakarta.
Mathews, C.K and K.E Van Hold. 1983.Biochemistry. The Bejamin Cumming
Publishing Company. Redwood City.
Toha,A.H. 2001. DNA Keanekaragaman, Ekspresi, Teknologi dan Efek
Pemanfaatannya. Penerbit Alfabeta. Bandung.
Wirahadikusumah,M. 1985. Biokimia, Protein, Enzim dan Asam Nukleat. Penerbit
ITB. Bandung.